بررسی کارآیی روش زنجیره ای پلیمراز با نسخه برداری معکوس در تعیین اشرشیاکلی در آب آشامیدنی.

Efficacy of RT-PCR for the detection of E. coli in drinking water


چاپ صفحه
پژوهان
صفحه نخست سامانه
چکیده مقاله
چکیده مقاله
نویسندگان
نویسندگان
دانلود مقاله
دانلود مقاله
علوم پزشکی اراک
علوم پزشکی اراک

نویسندگان: حمید ابطحی , احسان اله غزنوی راد , محمدجواد قنادزاده , محمود کریمی

کلمات کلیدی:

نشریه: فصلنامه علمی - پژوهشی فیض, 4,, - ,

اطلاعات کلی مقاله
hide/show

کد مقاله 1655
عنوان فارسی مقاله بررسی کارآیی روش زنجیره ای پلیمراز با نسخه برداری معکوس در تعیین اشرشیاکلی در آب آشامیدنی.
عنوان لاتین مقاله Efficacy of RT-PCR for the detection of E. coli in drinking water
نوع مقاله بر حسب نگارش پژوهشی اصیل
مقاله برحسب نمایه isc
IF
عنوان نشریه فصلنامه علمی - پژوهشی فیض
نوع نشریه علمی پژوهشی
شماره نشریه 4
دوره
صفحه شروع و پایان در نشریه -
سال انتشار/ ارائه شمسی
سال انتشار/ارائه میلادی
آدرس لینک مقاله/ همایش در شبکه اینترنت
ISSN
DOI
آدرس علمی (Affiliation) نویسنده متقاضی

چکیده مقاله
hide/show

عنوان متن
چکیدهچکیده زمینه و هدف : وجود اشریشیا کلی در آب نشان دهندۀ احتمال آلودگی مدفوعی آن است. از بین روشهای تشخیص این باکتری ، واکنش زنجیره ای پلی مرآز PCR (Polymerase chain reaction) از نظر سرعت ، دقت و کارآیی نسبت به سایر روشها ارجحیت دارد. از معایب این روش بروز نتایج مثبت کاذب می باشد. برای رفع این مشکل میتوان از آزمایشاتی از جمله واکنش زنجیره ای پلی مرآز معکوس ( = Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction RT-PCR ) استفاده نمود. لذا در این تحقیق سعی گردیده تا علاوه بر تعیین کارآیی روش RT-PCR ، مقایسه دو روش RT-PCR و MPN(Most Probable Number) در شناسایی اشریشیا کلی در آب نیز مورد بررسی قرار گیرد. مواد و روش ها : با استفاده از ترادف ژنی 16srRNA اشریشیا کلی پرایمرهای( S rRNA Forward) SF و SR(S rRNA Reverse) طراحی شد. رقتهای مختلف از باکتری در آب مقطر تهیه و به روش فیلتراسیون با دو نوع فیلتر (Fluoropore hydrophobic FHLP وHAWP ، سوسپانسیون باکتری از فیلترها عبور داده شد. پس از فیلتراسیون رقتها RT-PCR انجام گردید. شناسایی آلودگی 15 حلقه چاه آب شهر اراک و مقایسه آن با روش MPN برای بررسی کارآیی روش فوق انجام گرفت. Conclusion: Results of this study were shown that , RT-PCR can detect bacteria in low dilution of bacterial suspension. Hydrophobic filter (FHLP) have above ability from hydrophilic filter (HAWP) in separate bacteria.. So Successful RT-PCR amplifications were achieved by cells concentrated with hydrophobic filters for detection of all coliform bacteria. Key word: Water, Escherichia coli, Reverse Transcriptase –Polymerase Chain Reaction 1- Assistant professor, department of microbiology and immunology and medical and molecular Research Center of Arak University of Medical sciences. 2- MSc. Of Environmental Health, department of Health, Arak University of Medical sciences. 3- Associated professor, National Research Center for Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran. 4. MSc. of Microbiology, department of microbiology and immunology, Arak University of Medical sciences. 5- BSc of Microbiology, department of microbiology and immunology, Arak University of Medical sciences. 6- BSc of Cell and Molecular Biology *Corresponding Author: department of microbiology and immunology, Arak University of Medical sciences. Tel: 08614173502 –5 Fax: 08614173521 E-mail: h_abtahi2@yahoo.co.uk مقدمه : وجود میکروبهای بیماریزا از مهمترین معضلات بهداشتی آب آشامیدنی می باشد. شناسایی و حذف این عوامل از مسایل مهم بهداشتی آب بشمار می آیند . در روشهای تشخیصی ، از باکتری اشریشیا کلی به عنوان نشانگر برای بررسی آلودگی آب به فاضلاب استفاده میگردد. روشهای معمول ( نظیر MPN و کشت آب در محیطهای مربوط به آنتروباکتریاسه نظیر MacConkey, Endo, eosin methylene blue brilliant-green-lactose-bile) برای شناسایی عوامل بیماریزا در آب علاوه بر اینکه وقت گیر و پر هزینه هستند، از دقت کافی نیز برخوردار نمیباشند. به همین علت برای شناسایی وجود عوامل بیماریزا در آب روشهای جدیدی در دست مطالعه است(1). واکنش زنجیره ای پلیمرآز(Polymerase Chain Reaction =PCR ) از جمله روشهایی است که می تواند جایگزین مناسبی برای آزمایشات رایج باشد. روش اخیر حساس ، دقیق و سریع می باشد. کارآیی استفاده از PCR در مطالعات مختلف به اثبات رسیده است. روش فوق این توانایی را دارد که حتی یک باکتری در 100 مبلی لیتر آب را شناسایی نماید(2). از معایب روش PCR تکثیر DNA باکتریهای مرده و زنده میباشد. لذا در آبهایی که با عوامل ضد عفونی کننده نظیر کلر گند زدایی شده اند نمی توان حذف باکتری های زنده را در آب نشان داد(2). با توجه به پایداری اندک RNA در محیط ، تعیین وجود RNA با استفاده از روش واکنش زنجیره ای پلی مرآز معکوس(RT-PCR = Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction) میتواند نشانگر مناسبی برای سلولهای زنده بشمار آید. نکته مهم در استفاده از روش RT-PCR تعیین کارآیی آن درشناسایی تعداد کم باکتریهادر آب می باشد(3) . در این تحقیق سعی شده تا با تهیه رقتهای مختلف از باکتری اشریشیا کلی در آب کارآیی روش RT-PCR در شناسایی آن مورد بررسی قرار گیرد. علاوه بر آن نقش دو فیلتر هیدروفیلیک (HWAP ) وهیدروفوبیک (FHLP ) در جدا سازی باکتری و نتیجه واکنش RT-PCR مورد بررسی قرار گرفت. در نهایت برای تعیین کارآیی RT-PCR در شناسایی حداقل تعداد باکتری در آب و اهمیت نوع فیلترهای هیدروفوبیک در نتایج آن ، از 15 حلقه چاه تامین کننده آب شهر اراک نمو نه برداری گردید و به روش فوق و MPN از نظر وجود باکتری مورد بررسی قرار گرفت. استفاده از روش MPN تنها برای بررسی همخوانی با روش RT-PCR است. مواد و روشها : این مطالعه یک مطالعه تجربی است.این مطالعه در تابستان 1388 انجام گرفته است. باکتری مورد استفاده در این تحقیق شامل اشریشیا کلی سویه DH5α (تهیه شده از پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری) می باشد . تمام مواد شیمیایی مورد استفاده در این تحقیق از شرکت مرک (Merck ) و آنزیمها و سایر عوامل استفاده شده در واکنش زنجیره ای پلیمرآز از شرکت سیناژن (ایران) تهیه گردید. طراحی پرایمر ها و تهیه آن: در این مطالعه با استفاده از ژن 16s rRNA (شماره دسترسی :EF620925 ) از باکتری اشریشیا کلی . ترادف پرایمر های زیر استفاده گردید: Forward: 5" CGA GTG GCG GAC GGG TGA GT (FROM 81) Reverse: 5" TCG ACA TCG TTT ACG GCG TGG A (FROM 786) پرایمرهای طراحی شده توسط شرکت MWG آلمان (نماینده فرآیند دانش آرین) ساخته شد. رقتهای آب و فیلتراسیون : ابتدا رقتهای متوالی از سلول باکتری اشریشیا کلی در 100 میلی لیتر آب استریل تهیه گردید. برای تهیه رقتهای باکتری از محلول شماره یک مک فارلند استفاده گردید. برای این منظور ابتدا سوسپانسیون نظیر محلول شماره 1 مک فارلند از باکتری تهیه شد. سپس از این سوسپانسیون رقتهای متوالی تهیه گردید . رقتهای 100/8 تا 1600/1 از سوسپانسیونهای بالا تهیه گردید. برای تائید صحت تعداد باکتریها در رقتها یک میلی لیتر هر رقت باکتری در محیط نوترینت آگار بصورت پور پلیت ( Pour Plate ) استفاده شد. رقتهای تهیه شده طبق جدول شماره 1 در دو سری تهیه گردید . جدول 1- رقتهای تهیه شده از کلی فرم رقت 100/8 100/4 100/2 100/1 200/1 400/1 800/1 1600/1 تعداد باکتری 8 4 2 1 1 1 1 1 حجم آب(میلی لیتر) 100 100 100 100 200 400 800 1600 یک سری از رقتها از فیلترFHLP ( شرکت میلی پور با قطر 5/0 میکرون) و سری دوم ازفیلتر HAWP ( شرکت میلی پور با قطر 45/0 میکرون) عبور داده شدند. سپس در شرایط استریل فیلترها در داخل میکروتیوب 5/0 قرار گرفت. 50 میکرولیتر از آب حاوی یک دهم درصد دی اتیل پیروکربنات (DEPC water ) به میکروتیوب افزوده گردید. سپس میکروتیوبها با شدت ورتکس گردید تا سلول باکتریها از سطح فیلتر به مایع داخل میکروتیوب رها شود. تخلیص RNA و انجام RT-PCR : برای تخلیص RNA از کیت RNX-plus ( شرکت سیناژن ) استفاده گردید. جهت حذف آلودگی DNA از RNA خالص شده از آنزیم Deoxyribonuclease I استفاده گردید. برای حذف آنزیم مورد نظر پس از افزودن یک میکرولیتر اتیلن دی آمین تترا استیک اسید ( EDTA با غلظت 25 میلی مولار ) به مدت 10 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی گراد قرار گرفت. غلظت عوامل RT-PCR جهت تکثیر RNA به شرح زیر استفاده گردید: دو میکروگرم از RNA و20 میکرومول پرایمر برگشت اضافه شدو به مدت به مدت نیم ساعت در 70 درجه سانتی گراد قرار گرفت . سپس 10 میلی مولار دزوکسی نوکلئوزید تری فسفات (dNTP ) ، ممانعت کننده از فعالیت آنزیم ریبونوکلئاز به میزان 20 واحد ( Ribonuclease Inhibitor ) ، بافر با غلظت نهایی 1X افزوده شد. پس از انکوباسیون 5 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی گراد ، 200 واحد آنزیم ریورس ترانس کریپتاز (M-MuLV Reverse Transcriptase ) اضافه گردید و به مدت یک ساعت در دمای 42 درجه سانتی گراد در دستگاه ترمو سایکلر قرار گرفت. بعد از تولید cDNA برای تکثیر آن از PCR استفاده گردید. برای این منظور از غلضتها ی عوامل زیر جهت PCR استفاده شد: یک میلی مو لار از هر یک از پرایمرهای رفت و برگشت ، 5/2 میلی مولار از یون منیزیوم، 200 میلی مولار از هر یک از دزوکسی نوکلئوزید تری فسفات ، 5.2 واحد از آنزیم Taq DNA Polymerase و بافر PCR با غلظت 1X است. حجم نهایی مخلوط PCR با آب مقطر استریل به 50 میکرولیتر رسید پس از آن برنامه زیر استفاده گردید : مرحله اول PCR متشکل از سی و پنج چرخه که هر یک از سه قسمت تشکیل شده است. قسمت اول دناتورکردن (94 درجه سانتی گراد به مدت یک دقیقه) ، قسمت دوم برای اتصال پرایمرها به DNA الگو (47 درجه سانتی گراد به مدت یک دقیقه ) ، قسمت سوم جهت تکثیر ژن هدف (72 درجه سانتی گراد به مدت یک دقیقه ) است. پس از خاتمه چرخه ها، تکثیر نهایی در 72 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه و برای یک چرخه انجام شد. برای بررسی نهایی محصولات PCR ، الکتروفورز آن بر روی ژل آگارز 1% در بافر تریس بازی - اسید بوریک- EDTA (TBE با 8 = pH ) انجام گرفت. بررسی نتیجه الکتروفورز با استفاده از رنگ آمیزی آن با محلول اتیدیوم بروماید ومشاهده آن با دستگاه ترانس لومیناتور UV انجام گرفت. بررسی نمونه های آب چاه با RT-PCR و MPN : جهت تایید کارآیی روش فوق از 15 حلقه چاه تامین کننده آب شهر اراک نمونه گیری انجام شد. از هر چاه 250 میلی لیتر آب در ظروف استریل طبق استاندارد جمع آوری گردید. وجود کلی فرم در نمو نه های تهیه شده با استفاده از روش RT-PCR و MPN بررسی گردید. در RT-PCR یکصد میلی لیتر آب با استفاده از فیلتر FHLP صاف شده و سپس با استفاده از RT-PCR وجود اشریشیا کلی در آن بررسی شد. . آزمایش MPN بروش سه لوله ای انجام گرفت.که بر اساس تولید یا عدم تولید گاز تعداد اشریشیا کلی تعیین شد. داده های حاصل از سنجش نمونه ها از نقطه نظر آلودگی میکروبی و آزمون ملکولی بروش آمار توصیفی جمع آوری و در قالب جدول مربوط منعکس گردید. نتایج : کشت رقت های تهیه شده در محیط کشت نوترین آگار به روش پور پلیت تعداد باکتریها در این رقتهای را تایید نمود. نتیجه RT-PCR رقتها پس از فیلتراسیون نشان داد که این روش قادر است تا وجود 1 باکتری درحجم 1600 میلی لیتر آب را پس از فیلتراسیون با فیلتر هیدروفوبیک (FHLP ) شناسایی کند. در RT-PCR رقتها قطعه برابر bp 723 دیده شد. نتیجه RT-PCR در شکلهای 1 و2 آمده است. برای بررسی کارآیی روش RT-PCR ، نمونه برداری از 15 حلقه چاه انجام گردید. 100 میلی لیتر از نمونه آب به روش RT-PCR و 100 میلی لیتر آب به روش MPN از نظر وجود اشریشیا کلی مورد آزمایش قرار گرفت. نتیجه این مرحله از آزمایش در جدول شماره 2 آمده است. شکل 1- نتیجه RT-PCR رقتهای باکتری فیلتر شده با FHLP – ردیف 1: مارکر BP 100 – ردیف 2 : رقت 1600/1 –ردیف 3 : 800/1 – ردیف 4 : 400/1ردیف 5 : 200/1 – ردیف 6 : رقت 100/1 –ردیف 7 : رقت 100/2 –ردیف 8 : رقت 100/4 – ردیف 9 : رقت 100/8 شکل 2- نتیجه RT-PCR رقتهای باکتری فیلتر شده باHAWP – ردیف 1: مارکر BP 100 – ردیف 2 : رقت 1600/1 –ردیف 3 : 800/1 – ردیف 4 : 400/1ردیف 5 : 200/1 – ردیف 6 : رقت 100/1 ردیف 7 : رقت 100/2 –ردیف 8 : رقت 100/4 – ردیف 9 : رقت 100/8 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 شمارۀ چاه + + + + + + + + + + - + + + - RT-PCR - - - - + - + + - - + - + - - MPN جدول 2- نتایج تست RT-PCR و MPN آب 15 چاه تامین کننده آب شهر اراک بحث : نتیجه آزمایش RT-PCR بر روی رقتهای تهیه شده از کلی فرم نشان داد که این تست قادر است حتی یک باکتری را در حجم 1600 میلی لیتر آب نیز تعیین نماید. افزایش این کارآیی تنها در نمونه هایی دیده می شود که توسط فیلتر هیدروفوبیک (FHLP ) صاف گردید. در نهایت برای تعیین ارزش RT-PCR در شناسایی حداقل تعداد باکتری در آب و اهمیت نوع فیلترهای هیدروفوبیک در نتایج آن ، از 15 حلقه چاه تامین کننده آب شهر اراک نمو نه برداری گردید و به روش فوق و MPN از نظر وجود باکتری مورد بررسی قرار گرفت. برای بررسی وجود و تعیین میکروارگانیزمهای موجود در آب و اثبات آلودگی آن از روشهای مختلفی استفاده می گردد. اهمیت تعیین آلودگی آب باعث شده است تا استفاده از روشهای سریع و دقیق در اولویت قرار گیرند. از جمله این روشها استفاده از تکنیکهای مولکولار بیولوژی است. روش واکنش زنجیره ای پلی مرآز (Polymerase Chain Reaction= PCR ) روشی حساس و دقیق بوده که با استفاده از آن نه تنها وجود آلودگی مشخص می گردد ، بلکه نوع باکتری را نیز می توان تعیین نمود(4). پایداری نسبتا بالای DNA در محیط باعث می گردد تا نتیجه واکنش زنجیره ای پلی مرآز در مورد سلولهای مرده نیز مثبت گردد. چنانچه مطالعات نشان می دهد که انجام PCR با باکتریهای کشته شده توسط جوشاندن و یا اشعه UV با انجام PCR بر روی باکتریهای زنده نتیجه مشابهی را خواهد داشت. دیگر مطالعات صورت گرفته بر روی E.coli و لیستریا مونوسیتوزنز نشان میدهد که نتیجه فرآیند PCR بر با باکتریهای اتوکلاو شده نیز مثبت است(5). عیوب ذکر شده بر روشهای شناسایی ارگانیزمها بر پایه DNA باعث گردیده تا روشهای دیگری از جمله غنی سازی اولیه قبل از آزمایش PCR توصیه گردد.ولی با اینکه این روش باعث افزایش کارآیی آزمایش و شناسایی بین نمونه های زنده و مرده می شود ، ولی مستلزم افزایش مدت زمان تست می باشد.در عین حال در صورتی که تعداد باکتریهای مرده بالا باشد ، میتواند باعث بروز نتیجه مثبت کاذب در این آزمایشات نیز گردد(6). بطور کلی تکنیکهایی که بر پایه اسیدهای نوکلئیک میباشد تنها موقعی می تواند وجود سلولهای زنده را ثابت کند که ملکول هدف پایداری کمی پس از مرگ سلولی داشته باشد. ملکول mRNA در داخل سلول زنده مرتبا در حال تکثیر و افزایش بوده و بر عکس DNA نیمه عمر بسیار کوتاهی را دارد. بطوریکه پس از مرگ سلولی مقدار آن بسرعت در سلول کاهش می یابد. علت این کاهش بواسطه کارآیی بالای پیوند های فسفو دی استر نسبت به آنزیمهای هیدرولیز کننده در ملکول RNA نسبت به DNA است. بنابر این تعیین وجود ملکول mRNA نشانه خوبی برای اثبات وجود سلولهای زنده است. چنانچه در مطالعه شریدان (Sheridan) با استفاده از روش RT-PCR ثابت شده است که این ملکول تنها در سلولهای زنده ویبریو کلرا و لژیونلا پنموفیلا دیده می شود(7). نکته مهم در استفاده از روشهایی نظیر RT-PCR بررسی کارآیی این روشها در تعیین عوامل آلودگی آب است. در مقاله LIU نشان داده است که روش RT-PCR قابلیت شناسایی باکتری در سوسپانسیون با 1CFU/ml را ندارد(8). در عین حال نتایج تحقیق حاضر نشان میدهد که روش RT-PCR علاوه بر اینکه قادر به شناسایی یک باکتری را در 100 میلی لیتر آب است ، توانایی تشخیص یک باکتری در حجمهای بالاتر ( تا 1600 میلی لیتر آب ) را نیز دارد. تفاوت اخیر بین این مطالعه با دیگر مطالعات را باید در استفاده از فیلترهای هیدروفوبیک برای تغلیظ باکتریها بیان نمود.چنانچه در تحقیق بژ در نشان داده شده ، فیلترهای هیدروفوبیک نسبت به فیلتر های هیدروفوبیک توانایی بالایی را در جذب باکتریها دارند(9). نتایج این تحقیق نیز موید بر نظر اخیر است. چنانچه نتایج مربوط به RT-PCR فیلتر هیدروفوبیک نشان می دهد ، حتی رقتهای پایین باکتری عبور داده شده از این فیلترها عبور توسط روش این ملکولی قابل شناسایی است. علت این افزایش کارآیی بواسطه از دست ندادن باکتری و در نتیجه اسیدهای نوکلئیک باکتری می باشد. در عین حال استفاده از فیلترهای هیدروفیلیک ( نظیر HAWP ) با وجود اینکه قطر منافذ آن کمتر از فیلترهای FHLP است ، قدرت کمتری را در جذب باکتری نشان می دهد. فیلترهای HAWP تنها قادر به جدا سازی باکتری ها در رقتهای بالاتر از چهار باکتری در یکصد میلی لیتر آب است. بعبارت دیگر با استفاده از این فیلترها شناسایی باکتریها دررقتهای پایینتر از چهار باکتری توسط روش RT-PCR قابل استفاده نمی باشد. در این تحقیق کارآیی RT-PCR تا وجود یک باکتری در حجم حدود 2 لیتر آب افزایش پیدا کرد. کارآیی تشخیص آلودگی آب با استفاده روش فوق در مقایسه با روشهای معمول نظیر MPN را بخصوص می توان ملاحظه نمود. چنانچه در جدول شماره 2 آمده است در بین 15 چاه آب مورد مطالعه ، روش MPN تنها توانسته است آلودگی 5 چاه آب را نشان دهد . در عین حال در بررسی آلودگی آب چاههای فوق با روش RT-PCR از 15 چاه آب در13 نمونه آلودگی نشان داده شد. علاوه بر دقت و کارآیی بالای RT-PCR در تشخیص آلودگی آب کاهش مدت زمان شناسایی باکتری از اهمیت بالایی برخوردار است. بطوریکه در آزمایش معمول MPN حداقل به 24 ساعت برای تعیین آلودگی نیاز است . در حالیکه در روش RT-PCR این زمان به 6 تا7 ساعت کاهش می یابد. بنابر این استفاده از روش PCR در سیستمهای تصفیه و ضد عفونی آب بعلت پایداری ملکول DNA نتیجه آزمایش واکنش زنجیره ای پلی مرآز مثبت کاذب خواهد بود. بر این اساس برای بررسی آلودگی در سیستمهای تصفیه آب استفاده از روشهای ملکولی نظیر PCR نمی تواند اثر مواد ضد عفونی کننده بر روی شاخص آ لودگی آب را نشان د هد. برای رفع این مشکل می توان از دیگر ملکولهای سلول از جمله RNA که پایداری نسبتا کمی دارد استفاده نمود. برای تعیین وجود RNA در محیط لازم است از روش واکنش زنجیره ای پلی مرآز معکوس (RT-PCR Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction = ) استفاده شود. منابع: 1) Toze S. PCR and the detection of microbial pathogens in water and waste water. Wat. Res. 1999; 33(17): 3545- 3556 2) Gary WP. Molecular Diagnostics for the Detection and Characterization of Microbial Pathogens. Clin. Infect. Dis. 2007; 45: 99– 111 3)Vaitilling M,Gendre F and Brignon P . Direct Detection of Viable Bacteria, Molds, and Yeasts by Reverse Transcriptase PCR in Contaminated Milk Samples after Heat Treatment. Appl .Environ. Microb. 1998, 64(3): 1157–1160 4)Horáková K, Mlejnková H, Mlejnek P. Direct detection of bacterial fecal indicators in water samples using PCR. Wat. Sci. Tech. 2006; 54(3):135-40. 5) Kobayashi H, M Oethinger , MTuohy , G Procop , G Hall , T Bauer . Limiting false-positive polymerase chain reaction results: detection of DNA and mRNA to differentiate viable from dead bacteria. Diagn. Microbiol. Infect Dis. 2009; 64(4):445-7. 6)Sabat G, Rose P, Hickey J, Harkin J. Selective and sensitive for PCR amplification of Escherichia coli 16S rRNA Genes in soil. Appl . Environ. Microb. 2000. 66(2): 844- 849 7) Sheridan G, Masters C, Shallcross J AND Mackey B. Detection of mRNA by Reverse Transcription-PCR as an Indicator of Viability in Escherichia coli Cells. Appl. Environ. Microb,1998 ,64(4) : 1313–1318 8) Liu Y, Gilchrist A, Zhang J, and Li X. Detection of Viable but Nonculturable Escherichia coli O157:H7 Bacteria in Drinking Water and River Water. Appl. Environ Microb.2008,74(5):15-2-1507 9) Bej A, Mahbubani M, Dicesare J AND Atlas R. Polymerase Chain Reaction-Gene Probe Detection of Microorganisms by Using Filter-Concentrated Samples. Appl. Environ . Microb, 1991,57(12): 3529-3534
کلمات کلیدی
نام فایل عنوان پیوست تاریخ درج فایل اندازه فایل دانلود

نویسندگان
hide/show

نویسنده نفر چندم مقاله
حمید ابطحیاول و مسئول
احسان اله غزنوی رادچهارم
محمدجواد قنادزادهدوم
محمود کریمیپنجم

لینک دانلود مقاله
hide/show

نام فایل عنوان پیوست تاریخ درج فایل اندازه فایل دانلود
کاشان.pdf 1389/12/08 دانلود