بیان استرپتودورناز نوترکیب در باکتری اشریشیا کلی

بیان استرپتودورناز نوترکیب در باکتری اشریشیا کلی


چاپ صفحه
پژوهان
صفحه نخست سامانه
چکیده مقاله
چکیده مقاله
نویسندگان
نویسندگان
دانلود مقاله
دانلود مقاله
علوم پزشکی اراک
علوم پزشکی اراک

نویسندگان: حمید ابطحی , قاسم مسیبی

کلمات کلیدی:

نشریه: مجله علمی پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی اراک, 1,,96 - 103,

اطلاعات کلی مقاله
hide/show

کد مقاله 1697
عنوان فارسی مقاله بیان استرپتودورناز نوترکیب در باکتری اشریشیا کلی
عنوان لاتین مقاله بیان استرپتودورناز نوترکیب در باکتری اشریشیا کلی
نوع مقاله بر حسب نگارش پژوهشی اصیل
مقاله برحسب نمایه isc
IF 0.0
عنوان نشریه مجله علمی پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی اراک
نوع نشریه علمی پژوهشی
شماره نشریه 1
دوره
صفحه شروع و پایان در نشریه 96 - 103
سال انتشار/ ارائه شمسی
سال انتشار/ارائه میلادی
آدرس لینک مقاله/ همایش در شبکه اینترنت
ISSN
DOI
آدرس علمی (Affiliation) نویسنده متقاضی

چکیده مقاله
hide/show

عنوان متن
چکیده انگلیسیAbstract Background: In pyoderma infections, the density of pus is related to desoxiribonucleoproteins. The use of streptodornase (DNase) in combination with streptokinase can help dissolve purulent secretions of infections which results in healing the wound through the discharge of pus from the necrotic tissue. The aim of this study was to produce recombinant streptodornase from group A strain of Streptococcus pyogenes which is highly efficient in terms of active streptodornase production using expression vector. Materials and Methods: In this applied-fundamental study, genomic DNA of streptodornase gene (sd) was extracted by phenol-chloroform. Then by using specific primers of streptodornase gene, it was amplified through PCR. The resulting streptodornase gene was cloned in pGEX4T1-sd transformer for expression and the pGEX4T1-sd plasmid was transferred to the sd. E.coli BL21. Protein production was done by induction via IPTG and optimization of the conditions. The recombinant protein was purified using the glutathione sepharose 4B kit. Results: The nucleotide sequence of PCR and group A streptodornase Streptococcus was totally the same. The production of the streptodornase recombinant protein was done by inducing pGEX4T1-sd plasmid via Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside. Protein purification was done through affinity-chromatography by using glutathione sepharose 4B. The recombinant protein was reacted with anti-streptodornase mouse serum through Western-Blot method. Conclusion: Recombinant streptodornase can be produced by pGEX4T1 in E. coli. The recombinant protein maintains its antigenic property desirably. Noticing the domestic need in Iran, low rate of production, and pathogenesis of streptococci, production of this recombinant product is feasible. Keywords: Gene expression, Streptococcus group A, Streptodornaseباکتری با K وآنزیم پروتئیناز (SDS) 10 درصد و CTAB) CTAB/NaCl استفاده از محلول 0/7 مولار ) استخراج گردید. پروتئین ها و سایر اجزا NaCl سلولی با استفاده از مخلوط فنل /کلروفرم / ایزوآمیل الکل 13000 به مدت 10 rpm) 25 و سانتریفوژ /24/ به نسبت 1 به دست آمده با استفاده ازیک DNA . دقیقه) حذف گردید حجم ایزوپروپانول رسوب داده شد و سپس توسط اتانول 70 با استفاده از DNA درصد شستشو شد. کمیت و کیفیت TBE 0 درصد در بافر / الکتروفورز آن در ژل آگارز 8 تخلیص شده نیز با اندازه DNA بررسی گردید. مقدار گیری جذب نور در طول موج های 260 و 280 نانومتر به دست آمد. با استفاده از ترادف ژن استرپتودورناز طراحی پرایمرهای صورت گرفت: (Reverse) و عقب (Forward) جلو Forward:5'- AGG ATC CCG ACA AAC ACA GGT CTC -3' Reverse: 5'-TGG GAT TCT TTT TGA GTA GGT GTA CC-3' پرایمرها دارای ترادف لازم برای شناسایی و برش می باشند (ترادف EcoRI و BamHI توسط آنزیم مشخص شده اند). Underline آنزیم ها با در PCR تکثیر ژن استرپتودورناز با استفاده از بقرار PCR حجم 50 میکرولیتر انجام شد . غلظت عوامل الگو، یک میلی مو لار از هر پرایمر، DNA 500 نانو گرم از 2/5 میلی مولار از یون منیزیوم، 200 میلی مولار از هر Taq 2 واحد از آنزیم / دزاکسی نوکلئوزید تری فسفات، 5 1 است. برنامه استفاده X PCR و بافر DNA Polymerase به صورت: حرارت اولیه در 94 درجه PCR شده برای PCR سانتی گراد به مدت 5 دقیقه (یک س یکل)، مرحله دوم متشکل از سی سیکل که هر یک از سه قسمت تشکیل شده است . قسمت اول دناتوراسیون ( 94 درجه سانتی گراد به مدت یک دقیقه )، قسمت دوم برای اتصال پرایمرها به الگو ( 47 درجه سانتی گراد به مدت یک دقیقه )، DNA قسمت سوم جهت تکثیر ژن هدف ( 72 درجه سانتی گراد به مدت یک دقیقه ) است. در نهایت مرحله تکثیر نهایی در 72 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه است . بررسی نهایی با الکتروفورز آن بر روی ژل آگارز 1 PCR محصول انجام EDTA - درصد در بافر تریس - اسید بوریک گرفت. بررسی نتیجه الکتروفورز با استفاده از رنگ آمیزی آن با محلول اتیدیوم بروماید و مشاهده آن با دستگاه ترانس با PCR انجام گرفت. تخلیص محصول UV لومیناتور (Roche) استفاده از کیت تخلیص تهیه شده از شرکت رش بر اساس دستور العمل آن انجام گرفت. برای کلون سازی ژن استرپتودورناز در دو بترتیب زیر عمل گردید . pGEX 4T و 1 pTZ پلاسمید EcoRI و BamHI را با آنزیم های PCR ابتدا محصول برش داده وسپس در ناقلین ذکر شده وارد شد . لازم به ذکر و BamHI است که پلاسمیدهای فوق نیز با آنزیم های برش داده شد . عمل اتصال ژن استرپتودورناز در این EcoRI در T4 DNA ligase پلاسمیدها با استفاده از آنزیم حرارت 16 درجه سانتی گراد ب ه مدت یک شب انجام را به pGEX4T1SD و pTZ-SD گرفت. پلاسمیدهای و DH5α ترتیب در سلول های مستعد اشرشیا کلی سویه وارد می نماییم. برای انجام فرآیند BL سویه 21 ترانسفورماسیون از یون کلسیم و شوک حرارتی استفاده گردید. برای ت أیید صحت ترادف نوکلئوتید ژن به دست بیان استرپتودورناز نو ترکیب در باکتری اشریشیا کلی محمود کمانی و همکاران 100 مجله علمی پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی اراک، سال چهاردهم، شماره 1، فروردین و اردیبهشت 1390 به pTZ-SD ساختار پلاسمیدی PCR آمده از محصول در آلمان ارسال گردید. ترادف MWG شرکت با استفاده از روش سنگر PCR نوکلوتیدی محصول تعیین می گردد. (Sanger) (SD) برای تولید پروتئین استرپتودورناز -SD باکتری های اشرشیا کلی تراریخت شده با پلاسمید را در محیط نوترینت براث کشت داده و در pGEX4T1 حرارت 37 درجه سانتی گراد بر روی شیکر با حداقل 170 دور قرار می دهیم. پس از این که تعداد باکتری ها به حد از محلول یک مولار ایزوپروپیل (OD=0/ مناسب رسید ( 6 Isopropyl β-D- تیوگالاکتوپیرانوزید (- 1 به سوسپانسیون باکتری اضافه (thiogalactopyranoside گردید تا غلظت نهایی آن به یک میلی مولار برسد. چهار ساعت پس از افزودن ازوپروپیل تیوگالاکتوپیرانوزید 4000 به مدت نیم rpm رسوب باکتری ها با سانتریفیوژ در ساعت به دست آورده شد. برای بررسی نتیجه القا از الکتروفورز رسوب باکتری در ژلده درصد پلی آکریل آمید در حضور سدیم دود سیل سولفات استفاده گردید. تخلیص پروت ئین به وسیله کروماتوگرافی تمایلی با استفاده از کیت گلوتاتیون سفاروز 4 ب، بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده (کیاژن) انجام گرفت. برای ت أیید صحت پروتئین تولید شده از آزمون وسترن بلات استفاده شد . برای این منظور ابتدا به یک عدد موش در دو نوبت به فاصله یک هفته به صورت زیر جلدی و درون ص فاقی عصاره محیط کشت مولر هینتون براث حاوی استرپتوکوک پیوژن به همراه آدجوانت فروند تزریق گردید. پس از بالا رفتن تیتر آنتی بادی بر علیه این پروتئین سرم حیوان تهیه می شود. برای انجام تست ایمنوبلاتینگ (وسترن بلات ) پس از الکتروفورز رسوب باکتری های القا یافته بر روی ژل 10 درصد پلی آکریل آمید در حضور سدیم دودسیل سولفات، باندهای پروتئینی به دست آمده بر روی ژل آکریل آمید به کاغذ نیترو سلولز منتقل گردید . عمل انتقال در محیط بافری 25 می لی مولار تریس ، 192 میلی مولار گلایسین و 20 درصد متانول به مدت یک ساعت و در شدت جریان 90 ولت انجام گرفت . مرحله مسدود سازی 2 درصد / کاغذ نیترو سلولز با قرار دادن کاغذ در محلول 5 آلبومین سرم گاوی به مدت یک ساعت انجام شد . پس از مرحله مسدود سازی ، کاغذ نیترو سلول ز به مدت یک ساعت در سرم موش تلقیح شده با عصاره محیط کشت 1) و یک نمونه سرم موش تلقیح / استرپتوکوک پیوژنز ( 100 نشده (کنترل منفی ) قرار داده شد . پس از انکوباسیون یک ساعته با نمونه های سرم، نوارهای کاغذ نیتروسلولز سه مرتبه 0/02 مولار Tris ، نیم مولار NaCl شامل ) TBS-T با بافر 0/05 درصد ) شستشو شده و tween20 ، 8/ برابر 5 pH با به مدت یک ساعت با آنتی بادی موشی کونژوگه با 1) انکوبه گردید . در نهایت پس از / پراکسیداز ( 2500 برای مشاهده باندهای ، TBS-T شستشوی نمونه ها با بافر مربوط به واکنش آنتی بادی با آنتی ژن در کاغذ نیتروس لولز، قرار ( DAB ) کاغذ مزبور در محلول دی آمینو بنزیدین گرفت. یافته ها کروموزومی به دست آمده از DNA غلظت باکتری استرپتوکک پیوژن برابر 250 میکروگرم بر به عنوان الگو برای تکثیر DNA میلی لیتربرآورد گردید. این ژن استرپتودورناز استفاده گردید . اندازه قطعه ژن تکث یر یافته در مقایسه با مارکر حدود 816 جفت PCR توسط .( بازبود(شکل 1 : ستون 1 ، (SD) 816 مربوط به ژن استرپتودورناز bp شکل 1. باند PCR ستون 2 : محصول ، #SM مارکر 0321 pTZ نتیجه ترادف ژن تکثیر یافته که در پلاسمید بیان استرپتودورناز نو ترکیب در باکتری اشریشیا کلی محمود کمانی و همکاران 101 مجله علمی پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی اراک، سال چهاردهم، شماره 1، فروردین و اردیبهشت 1390 کلون گردیده بود، با ترادف ژن استرپتودورناز یکسان بود. پروتئین استرپتو دورناز پس از 4 ساعت از القا با تولید گردید. (IPTG) ایزوپروپیل تیوگالاکتوپیرانوزید وزن پروتئین تولید شده در حدود 38 کیلو دالتون است . نتیجه القای پروتئین استرپتودورناز در شکل 2 آمده است. pGEX4T در پلاسمید 1 (SD) شکل 2: القا پروتئین استرپتودورناز ستون 1: پروتئین مارکر، ستون 2:نمونه قبل از ، IPTG با استفاده از pGEX4T ستون 3: نمونه بعد از القا 1 ،pGEX4T القا 1 با (SD) خالص سازی پروت ئین استرپتودورناز استفاده ازکیت گلوتاتیون سفاروز 4 ب، بر اساس .( دستورالعمل شرکت سازنده انجام گرفت(شکل 3 با pGEX4T در پلاسمید 1 SD شکل 3. القاء و تخلیص پروتئین ستون 1: پروتئین مارکر، ستون 2:نمونه قبل از القا ، IPTG استفاده از ، pGEX4T1SD ستون 3: نمونه بعد از القا ، pGEX4T1SD ستون 4و 5: پروتئین تخلیص شده نتایج مربوط به واکنش آنتی بادی با آنتی ژن در آزمون وسترن بلات در شکل 4 آمده است . در عین حال هیچ باندی دال بر واکنش آنتی بادی با آنتی ژن در .( نمونه های سرم نرمال دیده نشد( شکل 4 شکل 4 . آزمون وسترن بلات؛ ستون 1: موش طبیعی ، ستون 2: سرم موش تلقیح شده با استرپتودرناز و ستون 3: پروتئین مارکر بحث مهمترین منبع تولید استرپتودورناز استرپتوکوک های بتا همولیتیک می باشند. تولید فرآورده های مختلف از جمله آنزیم ها از باکتری های بیماری زا با خطر انتقال و انتشار باکتری در محیط روبرو می باشد. بنابر این امروزه برای تولید فرآورده های این باکتری ها بیشتر از روش های بیوتکنولوژی استفاده می گردد. اشرشیا کلی به عنوان میزبانی برای بیان پروتئین های نوترکیب هم در تحقیقات و هم در صنعت به 13 ). برای تولید ، طور گسترده به کار می رود( 12 به BL استرپتودورناز نوترکیب در این مطالعه از سویه 21 عنوان میزبان استفاده شد که فاقد پروتئازهای سیتوپلاسمی از می باشد( 14 ). بنابراین HtpR وLon, OmpT, DegP جمله به دلیل BL سویه 21 E. coli بیان بالای استرپتودورناز در عدم حضور پروتئاز در این باکتری باشد. امروزه پلاسمیدهای مختلفی با وجود پروموتورهای قوی برای تولید پروتئین های نوترکیب وجود دارد. این پلاسمیدها دارای ساختاری می باشند که امکان 60- دستیابی به بیان بالای پروتئین به گونه ای که گاهی تا 70 درصد پروتئین تام باکتری، مربوط به پروتئین بیان شده توسط ناقل مورد نظر می باشد. بیان استرپتودورناز نو ترکیب در باکتری اشریشیا کلی محمود کمانی و همکاران 102 مجله علمی پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی اراک، سال چهاردهم، شماره 1، فروردین و اردیبهشت 1390 برای بیان پروتئین استرپتودورناز از ناقلین بیان استفاده (Fusion Protein) کننده با یک پ روتئین همراه برای تولید pGEX4T می شود. دراین تحقیق از ناقل 1 پروتئین نوترکیب استفاده گردید . با این که پروتئین القا شده در این سیستم متصل به یک پروتئین حدود 20 کیلودالتونی گلوتاتیون - اس- تراسفراز است. استرپتودورناز با وزن حدود 38 کیل ودالتون است . ولی پروتئین تولید شده در این تحقیق دارای وزن حدود 60 کیلو دالتون می باشد. علت این امر به واسطه افزوده شدن دنباله 22 کیلودالتونی گلوتاتیون ترانسفر از به پروتئین تولید شده است . بررسی انجام شده در این تحقیق و همچنین سایر تحقیقات نشان می دهد که وجو د این پروتئین اثری را در سایر پاسخ های ایمنی و سنجش های ایمنولوژیک (تست های الیزا ، تیت تکثیر لنفوسیتی وسنجش سیتوکاینی) ندارد. نتیجه آزمون وسترن بلات در این تحقیق نشان دهنده ساختار مشابه بین پروتئین نوترکیب تولید شده با فرم طبیعی آن است. میزان پروتئین تول ید شده در این طرح نسبتا کم می باشد. لذا لازم است تا با تغییر شرایط از جمله دما، محیط کشت، طول مدت القا ء، تغییر پلاسمید و سایر شرایط لازم در تحقیقات بعدی، میزان تولید پروتئین را افزایش داد. با وجود امکان تولید پروتئین نوترکیب در حامل ها و میزبان های گوناگون ، هنوز هم تخلیص پروتئین های نوترکیب به عنوان یک مسئله مهم مطرح است. یکی از مهمترین جنبه های تولید یک پروتئین، مرحله خالص سازی آن می باشد. هر مرحله خا لص سازی هزینه های خود را داشته و از طرف دیگر در هر مرحله بخشی از پروتئین به هدر رفته و یا غیر فعال می شود ، بنابراین هرچه مراحل خالص سازی کمتر باشد به همان اندازه روش تخلیص مناسب تر خواهد بود. از بین روش های خالص سازی، استفاده از ستون های کروماتوگرافی تمایلی یکی از مناسب ترین روش ها برای چنین منظوری می باشد که در آن پروتئین مورد نظر به صورت یک مرحله ای و با بازد ه فراوان به دست می آید. کلون نمودن ژن استرپتودورناز در ناقل استرپتودورناز نوترکیبی واجد دنباله اتصالی ، pGEX4T1 گلوتاتیون اس ترانسفراز را حاصل می آورد که می توان آن را به وسیله ستون کروماتوگرافی تمایلی با لیگاند گلوتاتیون تخلیص کرد. با توجه به نیاز داخلی ک شورمان به این دارو و قیمت بالای آن نیاز به تولید این دارو در کشور احساس می شود. بازدهی کم تولید و بیماری زایی استرپتوکوک ها دو دلیل عمده گرایش به سمت تولید این پروتئین به صورت نو .( ترکیب می باشد(
چکیدهچکیده زمینه و هدف: در عفونت های چرکی پوستی، غلظت چرک در ارتباط با دزاکسی ریبو نوکلئوپروتئین هاست .استفاده از استرپتودورناز که یک دزاکسی ریبونوکلئاز است به همراه استرپتوکیناز به حل شدن ترشحات کمک می کند ، در نتیجه ترمیم زخم در اثر خارج شدن چرک از بافت نکروز شده صورت می گیرد. هدف از این مطالعه تولید استرپتودورناز نوترکیب که از نظر تولید استرپتودورناز پر بازده است، توسط وکتور بیانی می باشد. A از سوش استرپتوکوک گروه ژنومی ژن استرپتودورناز با روش فنل - کلروفرم استخراج DNA ، مواد و روش ها: در این مطالعه بنیادی - کاربردی گردید، سپس با کمک پرایمرهای اختصاصی ویژه ژن استرپتودورناز، ژن مورد نظر با روش واکنش زنجیره ای پلی مراز جهت بیان کلون شد و پلاسمید pGEX4T1SD تکثیر شد . ژن ا سترپتودورناز به دست آمده در ناقل پلاسمیدی وارد باکتری اشریشیاکلی سویه بی ال 21 گردید. تولید پروتئین با القا توسط ایزوپروپیل pGEX4T1SD تیوگالاکتوپیرانوزید و بهینه سازی شرایط صورت گرفت. پروتئین نوترکیب با استفاده از کیت گلوتاتیون سفاروز 4 ب خالص گردید. کاملاً A یافته ها: ترادف نوکلئوتیدی محصول ژن واکنش زنجیره ای پلی مراز با ژن استرپتودورناز استرپتوکوک گروه توسط تیوگالاکتو پیرانوزید انجام pGEX4T1 SD یکسان بود. تولید پروتئین نوترکیب استرپتودورناز با القاء پلاسمید گردید. تخلیص پروتئین با روش کروماتوگرافی تمایلی و با استفاده از کیت گلوتاتیون سفاروز 4 ب انجام شد. سرم موش واجد آنتی استرپتودورناز در روش وسترن بلات با پروتئین تولید شده واکنش داد. در میزبان اشریشیاکلی نیز امکان pGEX نتیجه گیری: تولیداسترپتودورناز نوترکیب با استفاده از ناقلین پلاسمیدی نظیر پذیر است . پروتئین تولید شده خاصیت آنتی ژنیک خود را به خوبی حفظ می کند. با توجه به نیاز داخلی کشور و همچنین بازدهی کم تولید و بیماری زا بودن استرپتوکوک ها تولید این محصول به صورت نوترکیب امکان پذیر است. استرپتودورناز ، بیان ژن ،A واژگان کلیدی: استرپتوکک گروه
کلمات کلیدی
نام فایل عنوان پیوست تاریخ درج فایل اندازه فایل دانلود

نویسندگان
hide/show

نویسنده نفر چندم مقاله
حمید ابطحیمسئول
قاسم مسیبیدوم

لینک دانلود مقاله
hide/show

نام فایل عنوان پیوست تاریخ درج فایل اندازه فایل دانلود
HBI_Journals-v14n1p96.pdf 1390/06/29 دانلود